DEVEDESETIH GODINA PROŠLOG VEKA, usled razvoja PCR tehnike došlo je do pojave revolucionarnog koncepta u biološkim naukama - ideje o standardizovanom molekularnom sistemu identifikacije. Ranih 2000-ih, ova vizija pronašla je svoje ostvarenje u projektu “Barcode of Life”, globalnoj inicijativi koja ima za cilj stvaranje univerzalnog sistema za identifikaciju i klasifikaciju života na Zemlji temeljenog na standardnom molekularnom pristupu.
Projekat je zvanično započet 2003. godine i stekao je međunarodni zamah 2004. godine osnivanjem “Consortium for the Barcode of Life” (CBOL). Na čelu ovog transformišućeg poduhvata bio je Dr. Paul Hebert, prozvan osnivačem DNK barkod projekta. Dr. Hebert je, zajedno sa svojim timom, izneo ambicioznu viziju - klasifikovati celokupan živi svet koristeći jedinstvenu DNK sekvencu kao univerzalni identifikator. Ovo bi omogućilo bržu i efikasniju identifikaciju i klasifikaciju vrsta u odnosu na tradicionalne morfološke metode. Ideja o stvaranju prenosivog uređaja za identifikaciju vrsta takođe je bila deo ovog revolucionarnog poduhvata. I, dok se prva ideja pokazala teškom za izvođenje, 20 godina kasnije svedoci smo tehnološkog napretka koji otvara vrata ostvarivanju druge Hebertove vizije.
COI sekvenca i DNK barkod sistem
Genomski pristup u dijagnozi taksona se zasniva na proučavanju diverziteta DNK sekvenci. Upotrebom konzervativnih molekularnih sekvenci je moguće obrazovati i dijagnostifikovati molekularnu operacionu taksonomsku jedinicu (MOTU) koja bi odgovarala vrsti tradicionalnog koncepta. Molekularna operaciona taksonomska jedinica, predstavlja genetski definisanu grupu organizama koja se identifikuje na osnovu molekularnih podataka umesto tradicionalnih morfoloških karakteristika. Dr. Hebert i saradnici su smatrali da DNK taksonomija ili DNK barkod sistem bi trebalo da se zasniva na analizi kratkog standardizovanog segmenta genoma mitohondrijskog gena citohrom oksidaze subjedinice 1 (COI ili cox1), dužine od 650bp u blizini 5’ kraja. Ovaj molekularni marker je predložen za globalni bioidentifikacioni sistem životinja kreiranjem COI profila zbog postojanja univerzalnih početnica i većeg filogenetskog signala od bilo kog drugog mitohondrijskog gena, kao i vrlo retkih delecija i odsustva jedarnih pseudogena. Diverzitetom odabrane sekvence je obezbeđena identifikacija vrsta mnogih grupa životinja, uključujući ptice, ribe, pauke i leptire. COI sekvence postale su ključni deo DNK barkod pristupa. Njihova relativna kratkoća omogućavala je brzo i jeftino sekvenciranje, dok su istovremeno bile dovoljno duge kako bi mogle pokazati razlike između vrsta.
Jedna od ključnih kritika ovog pristupa jeste da pojedinačni molekularni marker, poput COI, neće nužno pružiti dovoljno informacija da bi se postigla rezolucija potrebna za identifikaciju velikog broja vrsta što je zapravo suština ove inicijative. Na osnovu dosadašnjeg iskustva istraživača mnogobrojnih grupa jednostavno je nemoguće teoretski zamisliti jednu sekvencu koja bi odgovarala neverovatnom diverzitetu živog sveta.
Uopšteno govoreći, nedostatak rezolucione moći COI sekvenci za određene taksonomske grupe naveo je CBOL da razmotri prelazak s prvobitne ideje upotrebe jednog referentnog gena (COI barkod sistem) na DNK barkod sistem koji bi, osim COI sekvence, obuhvatao više referentnih sekvenci, poznatog i kao ne-COI barkod sistem.
|
1. 2. 3. Prikaz dostupnih informacija na BOLD System platformi za vrstu Ursus arctos, odnosno mrkog medveda |
Barcode of Life Data System (BOLD System)
Centralno mesto za DNK barkod zajednicu zauzima Barcode of Life Data System (https://www.boldsystems.org/). Nakon što je ciljana DNK sekvenca amplifikovana i sekvencirana unosi se u navedenu bazu podataka, te postaje barkod. Ova platforma ne samo da skladišti DNK barkodove, već pruža sveobuhvatnu analizu informacija o taksonomiji, staništu, slike vrsta i geografske podatke o uzorcima. Takav integrisani pristup olakšava potpuniju karakterizaciju organizama. Čim su rezultati spremni za javno objavljivanje, kopija svih sekvenci i ključnih podataka o uzorcima sa BOLD System platforme migrira ka vodećim genomskim repozitorijumima širom sveta, poput Genbank baze podataka u Nacionalnom centru za biotehnološke informacije (NCBI). Za razliku od drugih dobro poznatih biblioteka sekvenci (npr. NCBI), BOLD System ima interaktivno sučelje gde deponovane sekvence mogu biti revidirane i ponovno taksonomski razvrstane.
Izazovi i Napredak: Prenosivi Sekvenatori
Dok razmatramo postignuća u DNK barkod projektu tokom protekle dve decenije, ključno je priznati da prva Hebertova ideja, klasifikacija celokupnog života na osnovu jednog DNK segmenta, nije bila lako izvodljiva. Međutim, tehnološki napredak, otvara nova vrata za postizanje druge Hebertove vizije - prenosivog uređaja za identifikaciju vrsta veličine mobilnog telefona. Ključna prekretnica dolazi razvojem prenosivih sekvenatora, posebno MinION uređaja kompanije Oxford Nanopore Technologies.
MinION i slični mali prenosivi sekvenatori predstavljaju prekretnicu u pristupu biodiverzitetu. Sa sposobnošću brzog sekvenciranja u terenskim uslovima, otvara se mogućnost za široku primenu. Identifikacija vrsta na licu mesta, povezivanje sa globalnim bazama podataka, i brza razmena informacija preko interneta postaju realnost. Mobilna tehnologija za sekvenciranje brzo napreduje kako se uređaji smanjuju i postaju jeftiniji. Na taj način, takođe, postaju i pristupačniji naučnicima u nerazvijenim delovima sveta, gde zapravo najčešće i postoji visoka stopa biodiverziteta.
Primena DNK barkod sistema
Živimo u doba neviđenog gubitka biodiverziteta, što utiče na taksonomsku kompoziciju ekosistema širom sveta. Pristup skupim tehnologijama za sekvenciranje DNK visokog protoka (high-throughput DNA sequencing technology, HTS) često je ograničen u zemljama u razvoju, posebno u udaljenim i teško dostupnim ekosistemima od posebnog konzervacionog značaja. Pojava jeftinih prenosivih laboratorija i tehnologija za sekvenciranje DNK uveliko olakšava projekte praćenja biodiverziteta širom sveta.
DNK barkodiranje, takođe, pruža nove uvide u ekologiju i biologiju vrsta. Identifikacija organizama iz stomačnih ekstrakata omogućava razumevanje ishrane divljih životinja, posebno kada nisu moguća bihejvioralna istraživanja. Takođe, ovaj metod može postati efikasan alat za razjašnjavanje odnosa domaćin-parazit i simbiotskih veza, pružajući nove uvide u spektar domaćina i geografske distribucije vrsta.
DNA barkodiranje nije korisno samo za naučna istraživanja biodiverziteta, već i za oblasti javnog zdravlja i biosigurnosti. Informacije dostupne putem BOLD System platforme imaju mnoge primene, uključujući praćenje promena u životnom okruženju, osiguranje bezbednosti hrane i medicinske analize. Ideja je da se DNK barkod sistem može koristiti za identifikaciju larvi invazivnih štetočina, otkrivanje novih vrsta, identifikaciju vrste koja je izazvala ubod, ujed ili trovanje, praćenje bioloških materijala koji prelaze međunarodne granice, kao i proveru biljnih ili životinjskih sastojaka u hrani.
Takođe je od velike važnosti za carinske i nacionalne vlasti u oblasti zaštite retkih divljih vrsta. Međunarodni ugovori poput Konvencije o međunarodnoj trgovini ugroženim vrstama divlje flore i faune (CITES) kategorizovali su više od 35.000 vrsta kao ugrožene izumiranjem. DNK barkodovi su se pokazali korisnim u praćenju ilegalnog sakupljanja i trgovine zaštićenih vrsta.
Ono što danas znamo jeste da nijedan pojedinačan pristup klasifikaciji ne može biti univerzalan za sve vrste. Nakon velikog broja publikacija može se reći da, iako izaziva mnogo kontroverzi, u principu postoji upotrebljivost molekularne taksonomije određenih sekvenci DNK u većini slučajeva. Na žalost mnogih, postoje i izuzeci, a to su upravo oni taksoni koji predstavljaju najveće probleme – kriptične vrste i blisko srodni taksoni sa kratkim periodom evolucione nezavisnosti. Stoga, morfologija u kombinaciji sa DNK sekvencama i dalje ostaje kao pouzdan i efikasan resurs karaktera za identifikaciju i klasifikaciju vrsta.
Izvori informacija:
, 
KOJI TELESKOP DA KUPIM?
